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ELISA常见问题分析与对策

异常

结果描述

原因分析

对策

白板

显色步骤结束后,酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。

试剂已过效期,或不同试剂盒组分混用

检查试剂的组分及批号,确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B

严格按说明书的步骤操作,加完试剂后可观察一下液面高度是否一致,以减少漏加现象。

洗板及加样过程中,酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等,确认配制洗液的容器已洗干净。

终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制

每次配制时都应看清标签标明物质。

蒸馏水有问题

确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染,与好蒸馏水比较。

显色弱、灵敏度低

实验结束后,包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。

试剂盒超过期, 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号; 试剂盒没有按规定进行保存,受高温影响;

实验前检查试剂的组分及批号,确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下,按使用规定储藏。

试剂、样品用前未平衡至室温

从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。

加入试剂的体积和时间有误, 移液器计量不准,吸嘴内水分太多或不清洁;

确定所使用的试剂体积正确,加入时间适当。 校正移液器,移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快,排放应完全。

洗板及加样过程中,酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力;

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等,确认配制洗液的容器已洗干净,确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。

孵育时间及孵育温度未达到要求 ,反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。

孵育温度应控制在 37-38℃,孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门,以免影响保温。

洗板次数过多,或浓缩洗液稀释倍数不符合要求;洗涤冲击力太大。浸泡时间太长;

严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板,减小洗涤冲击力,按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。

显色剂加量不足或顺序颠倒,或混合后加入;

显色剂滴瓶垂直向下,持力均匀,滴速不宜过快,先加显色剂 A,后加显色剂B,不可将A、B液混合后加入。

底物作用时间不够;

准确定时。

蒸馏水水质有问题;

测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。

实验结束后,阴阳性对照正常,质控正常,但临床标本感觉显色较弱

待测标本中可能不含强阳性标本,故结果可能是正常的

如有怀疑,可复检

标本加入叠氮钠作为防腐剂

酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂,可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂

阴阳性对照正常,但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。

未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本,但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出。

确认孵育的温度及孵育时间达到要求。

质控品或标本高温放置过久,或被反复冻融致待测物滴度下降,而未能检出

质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的,可存于 2-8℃,如需长期保存,应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装,并置于-20℃以下保存。

仪器设定不正确,滤光片不匹配。

重新设定酶标仪的参数,特别是检查滤光片是否匹配。

终止后,目测结果正常,但酶标仪读值结果偏低

酶标仪参数设定不正确。

重新设定酶标仪的参数,特别是检查滤光片是否匹配。

灵敏度过高、板底高、高背景

终止后,整板结果显现均一的黄色或淡黄色;或阴阳性对照、质控正常,标本阴性标本 OD值过高。

整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成,如同时操作两对半试剂时,测 HbsAb板用于测HBsAg等;

实验前检查试剂的组分及批号,确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象;

避免试剂组分间的交叉污染,确保吸头、容器的干净。

显色剂在光照条件下放置过久,实验前已变蓝

显色剂 A、B未使用前避光保存

孵育温度过高或孵育时间过长;

孵育温度应控制在 37-38℃,孵育时间严格按照说明书操作。

未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液,易造成花板黄板现象

严格按说明书要求洗板。

花板,一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成

放置时间(自然放置 1~2h)及离心转速(3000r/min)、离心时间(15min)应引起注意。

出现随机性的花板、跳孔现象

样品离心不完全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分;

充分离心, 3000rpm6分钟以上。

加样时交叉污染;

加标本时尽量 避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂,易脱落,应远离酶标板。

手工洗板造成的交叉污染

手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去,后几次再设定浸泡时间,可减少交叉污染

洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大,造成 花板、跳孔

疏通加液头,使洗板时每孔均注满洗液,吸液时残留量要小。

拍板时交叉污染

洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾,不要把无关物质拍进板孔,并尽量不要在同位置拍,以免交叉污染。

假阳性

假阳性现象是一个综合现象,可参考上文 “灵敏度过高、板底高、高背景” 中的分析。这里只列举常见的原因及对策。

计算 Cutoff值时使用的公式不正确,导致计算得出的CutOff值过低,从而导致出现假阳性

CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书,应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同。

洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够, 洗涤不充分,样品中有其他成分残留 导致花板、跳孔,假阳性增多

严格按说明书要求洗板。调整洗板机时,应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符,应根据实际情况调整至每孔注满。

血清标本处理不当,如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象,此标本重复实验结果往往是阴性;

放置时间(自然放置 1~2h)及离心转速(3000r/min)、离心时间(15min)应引起注意。

厂家试剂质量的变化造成;

国家标准要求提高灵敏度时,厂家试剂灵敏度也相应提高,假阳率常常有所上升,但只要在合理范围,是可以接受的。

水质问题;

防止蒸馏水污染。

加酶量过多(如 50uL误认为100uL)或丙肝酶稀释时加量过多;

加酶前检查移液器调节量是否准确,稀释酶时思想要集中。

培养箱温度超过 37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过;

放入板以前要检查培养箱的温度,准确定时。

底物配制时间过长、或底物污染;

底物应在酶反应完毕即将洗涤前 5分钟配制,注意避光。

该批样品放置时间过长,样品污染;

样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染。

移液嘴重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物;

移液嘴尽可能一次性使用。

重复性差

 

1、样品数量不一,加样时间长短不一;

重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近。

2、样品加入后未混匀;

加样后在混匀器上充分混匀。

3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对;

TMB显色用450/630波长.

4、酶标仪测定重复性差;

校对酶标仪。

5、洗涤不正确;

洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下,垂直用力甩净内容物(可多甩几次),在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔,洗涤应充分。

6、温育条件不一致(一次用水育,一次用恒温箱)

恒温箱温育较水浴显色深, OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。

7、不慎多加或少加酶或显色剂;

多加时显色深,少加则浅,用记号笔圈上,便于分析。

8、阈值附近时阴时阳;

同一样品做三个复孔,以二个(含二个以上相同结果为准)

9、加样量不足、保温时间、洗涤条件一致;

尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。

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