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免疫组化 非特异性染色

① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是,并不是每一种组织均需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富的组织,如肝脏、肾脏等,需考虑此原因。处理的方法为:
灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑(24mg/m1)加入底物液中,并保持pH值在7.6~8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶,可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素,以饱和内源性生物素,使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。
② 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清,用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片,以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白,如牛血清白蛋白也常应用。另外,取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭,效果也不错。
③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④ 一抗的使用浓度是否过高。
⑤ 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐,这亦有利于减低背景着色,通常0.05mol/l Tris—HCl,0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法,溶液内加入吐温20,效果更佳。特殊标记时,试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色,使用浓缩型DAB试剂盒时,请严格按照说明书标明的滴加顺序操作,注意校正蒸馏水的pH值,以确保实验结果的正确性;粉剂DAB溶解时,常有一些不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上,产生斑点状着色。另外,DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上,因此需将DAB保存于避光干燥处,现用现配,临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸,否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
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